Bevezetés: A leggyakoribb lizoszomális tárolási betegségben, a Fabry-betegségben,
a galaktozidáz
alfa (GLA) gén által kódolt alfa-galaktozidáz (AGAL) enzim hiányzik vagy biológiai
aktivitása kórosan
módosult. A jelenleg diagnosztikában alkalmazott ELISA-alapú átlagos enzimaktivitás
nők esetében
igen korlátozottan alkalmazható.
Célkitűzés: Új, egy-sejt szintű AGAL enzimaktivitás detektálására alkalmas áramlási
citométeres esszé
fejlesztéséhez szükséges Jurkat T-sejtes sejtvonalban célzott GLA génkiütött sejtvonal
létrehozása.
Anyag és módszer: A GLA 1. exonjára tervezett 3 irányító RNS (sgRNS) tervezését követően,
Jurkat
(E6.1 klón) T-sejtes sejtvonalban CRISPR-Cas9-alapú nukleofekcióval transzfektáltuk
a sejteket. A
hígításos-alapú egy-sejt klónozással létrehozott tiszta Jurkat GLA KO sejtvonal transzfekciós
validálását DNS szinten teljes-exom szekvenálással, RNS szinten qPCR-rel, az enzimaktivitást
pedig
globotriaozil-ceramid szubsztrátfelhalmozódás elemzésével végeztük.
Eredmények: A Jurkat sejtek fehérjeexpressziós vizsgálata alapján T-sejteknek megfelelő
expressziós
mintázatot azonosítottunk, valamint PCR-alapú módszerrel a mycoplazma fertőzést kizártuk.
A sejtek
közvetlen posztnukleofekciós transzfekciós hatékonysága 41,46%, míg a transzfektált
sejtek viabilitása
95% feletti volt. Az egy-sejt klónok expanzióját követően a kiválasztott GLA KO klón
validálása DNS
szinten a seq[GRCh38] NC_000023.11(NM_000169):g.101,407,776_101,407,812del megtörtént,
illetve a
fehérjét kódoló génekben szerkesztés nem történt. A klónban RNS szinten nem volt detektálható
a
GLA expressziója. Az enzimaktivitás mérés során jelentős intracelluláris szubsztrátfelhalmozódás
volt
megfigyelhető a Jurkat sejtekben.
Diszkusszió: A nukleofekcióhoz tervezett gRNS specifitás ellenőrzésének céljából in
silico off-target
analízist végeztünk. Az off-target analízis során az 1-4 nukleotid részleges komplementaritási
hasítóhelyeket elemeztük, de nem találtunk a génszerkesztett sejvonalban a célszekvencián
kívüli
eltérést.
Következtetés: AGAL egy-sejt szintű enzimaktivitás fejlesztéséhez alkalmas Jurkat
GLA KO sejtvonalat
hoztunk létre, amelyet multiomikai vizsgálatokkal sikeresen validáltunk.
Finanszírozás: Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal OTKA PD138521
Humán Genomért Alapítvány 2022/2023 kutatási pályázata
