Bevezetés: Adott gén több transzkriptuma közül vajon melyik/melyek a biológiailag
aktív/ak? Melyiket tekintjük kanonikusnak? Az Ensembl, az UniProt/SwissProt és NCBI
definíciói sem egyértelműek. Az amerikai irányelv szerint a null mutációt akkor tarthatjuk
patogénnek, ha az ismerten biológiailag aktív transzkriptumo(ka)t érint, ha az utolsó
3’ vég felé eső ismert patogén mutációtól upstream irányban helyezkedik el, és ha
olyan exonban található, amiben már korábban is leírtak patogén variánst. A kanonikus
transzkriptum azonosítása tehát közvetlen klinikai jelentőséggel bír.
Munkacsoportunk a podocin interallélikus interakcióinak in vivo C. elegans modelljének
létrehozásán dolgozik, a podocin variáns párok patogenitásának tanulmányozása céljából.
Ehhez a féreg homológ génjének (mec-2) transzkriptumait kellett feltérképeznünk.
Anyagok és módszerek: Expressziós vektorokat a NEB HiFi DNA Assembly kit segítségével
hoztunk létre, a különböző MEC-2 izoformákat a mec-2 saját promotere alatt fejeztettük
ki, és a cbr-unc gént, mint szelekciós markert alkalmaztuk. Kettős mutáns féregtörzseket
keresztezéssel hoztunk létre (unc-119 és mec-2). Az extrakromoszómális expresszió
okozta mennyiségi különbségek elkerülése érdekében MosSci (Mos1-mediated Single Copy
Insertion) technikát alkalmaztunk a genomi integráció elősegítésére. A vektorokat
a férgekbe génpuska segítségével juttattuk be. A finomérintés reakciót vaktesztben
macskabajusz segítségével vizsgáltuk. Az RNS expressziót és mennyiségeket kvalitatív
és kvantitatív PCR segítségével határoztuk meg, a férgekből történt totál RNS izolálás
után.
Eredmények: A féregben a MEC-2 fehérje a finomérintésre adott válaszreakcióért felelős,
a null mutáns féregtörzsek nem reagálnak a finomérintésre. A null mutáns féregtörzseket
sikeresen transzformáltuk a korábban kanonikusként leírt MEC-2A izoformát kódoló vektorokkal.
Miután nem tapasztaltunk finomérintés reakciót az RNS normál mennyisége mellett, az
Ensembl adatbázisban leírt 17 izoformát kezdtük vizsgálni. Először kizártunk hetet,
az expressziójuk hiánya miatt. Egy 16 kb hosszú genomi szekvenciával sikerült komplett
menekítést elérnünk, mely tartalmazza hat izoforma kódoló szakaszait a fennmaradt
tízből. Irodalmi adatok segítségével további izoformákat tudtunk kizárni, végül a
MEC-2E izoformával sikerült elérnünk a várt menekítő hatást. Fischer-exact teszt segítségével
kimutattuk, hogy a MEC-2E izoformát hordozó törzsek finomérintés reakciója nem különbözik
a vad típusétól, de szignifikánsan különbözik a null mutánsétól (p<0,00001), míg a
MEC-2A izoformát egy kópiában integránsan hordozó féregtörzsek finomérintés reakciója
szignifikánsan elmarad a vadétól (p<0,00001), de nem különbözik a null-mutánsétól.
Következtetés: A C. elegans mec-2 génjének nem az irodalomban kanonikusként leírt
„A” izoformája a biológiailag aktív, hanem a C-terminális régióban 758 aminosavval
hosszabb régiót kódoló „E” izoforma. A kanonikus izoforma azonosítása meghatározó
a mutációk patogenitásának megítélésében, de ez állatmodell vizsgálatát teheti szükségessé.
